固定是組織處理最重要的一步，也是在整個(gè)制片過程中最無法補(bǔ)救的一步。所謂“固定”，就是組織離體后，用各種辦法

使其細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)盡可能接近其生活狀態(tài)時(shí)的形態(tài)結(jié)構(gòu)和位置的過程。固定的目的是為了防止組織、細(xì)胞自溶與腐敗，防止細(xì)胞內(nèi)

酶對(duì)蛋白質(zhì)的分解作用，使細(xì)胞內(nèi)的各種成分如蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物或酶類轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄晕镔|(zhì)，以保持原有的結(jié)構(gòu)與生活時(shí)

相仿。另外，組織固定后，具有硬化作用，增加了組織的韌性，有利于取材和組織脫水。如果標(biāo)本沒有及時(shí)固定或固定不恰當(dāng)，組

織已經(jīng)自溶或腐敗，將無法逆轉(zhuǎn)。

固定的注意事項(xiàng)：

（1）固定必須及時(shí)：組織離體后，必須立即固定（在1小時(shí)內(nèi)）。

（2）固定液的選擇：固定液的選擇非常重要，應(yīng)該根據(jù)制作要求選擇合適的固定液。最常用的固定液是4%甲醛液或4%中性緩沖甲

醛液。

（3）固定液的量：必須大于組織體積的4-10 倍。

（4）固定液的濃度：濃度必須準(zhǔn)確，過稀或過濃都會(huì)影響組織的形態(tài)和固定的效果。

（5）固定液的質(zhì)量：發(fā)現(xiàn)固定液變質(zhì)，如甲醛液體產(chǎn)生白色沉淀，應(yīng)立即更換。

（6）固定的溫度：室溫或放于35-37℃的全封閉組織處理機(jī)內(nèi)，溫度過高，會(huì)加快組織的自溶和組織的過度收縮，并破壞細(xì)胞內(nèi)的

抗原和DNA。

（7）固定的時(shí)間：新鮮標(biāo)本，應(yīng)該剖開固定12-24小時(shí)后再取材。大標(biāo)本取材后在室溫下還需再固定4-6小時(shí)，小標(biāo)本取材后應(yīng)該

在室溫下再固定3-4小時(shí)，如果是新鮮小標(biāo)本取材，必須再固定4-8小時(shí)。如果室內(nèi)溫度低，固定時(shí)間還需延長(zhǎng)。固定時(shí)間不超過48

小時(shí)。

（8）需要做分子病理的標(biāo)本，從標(biāo)本離體至組織脫水開始，總固定時(shí)間一般不要超過24小時(shí)（厚度2mm），同時(shí)決不要少于6小

時(shí)。

（一）最常用的固定液：

（1）4%甲醛液（10% 福爾馬林液）：甲醛（HCHO）是一種無色易溶的刺激性氣體。市售甲醛水溶液實(shí)際濃度為40%，易揮發(fā)，日久

會(huì)自行分解，產(chǎn)生白色沉淀(副醛：多聚甲醛或三聚甲醛)，并有甲酸產(chǎn)生，影響組織的固定和細(xì)胞核的染色。長(zhǎng)期保存應(yīng)該加入碳

酸鎂、碳酸鈣等碳酸鹽中和。我們用作病理標(biāo)本固定的為4％甲醛水溶液（9份水加1份濃甲醛液，實(shí)際含甲醛4％，俗稱10% 福爾馬

林液）。甲醛是通過使蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)而產(chǎn)生固定作用，組織穿透性好，組織收縮小，HE染色對(duì)比鮮明 ，能完好地保存組織

的形態(tài)。但交聯(lián)和共價(jià)鍵的形成改變了蛋白的三維結(jié)構(gòu)并覆蓋了抗原的決定簇，降低了組織的抗原性，因此，現(xiàn)在國(guó)際上都提倡使

用10%中性緩沖福爾馬林液。

優(yōu)點(diǎn)：①滲透能力較強(qiáng)，固定均勻。②收縮小。③能保存脂肪和類脂體（冰凍切片法）。④增加組織韌性。⑤有利于嗜銀染色。⑥

可固定高爾基體和線粒體。

缺點(diǎn)：①不能沉淀核蛋白的白蛋白。②溶解組織內(nèi)尿酸鹽結(jié)晶。③經(jīng)甲醛固定的陳舊組織較容易產(chǎn)生色素沉淀。（可用堿性乙醇去

除：濃氨水1ml加入75%乙醇200ml內(nèi)，切片脫蠟后浸入上述液體30分鐘；或者1%氫氧化鉀1ml加入80%乙醇100ml內(nèi)，切片脫蠟后浸入

上述液體10分鐘。如還沒有去除干凈，可以再延長(zhǎng)，處理完成后流水沖洗5分鐘，常規(guī)染色）。

（2）4%中性緩沖甲醛液（10%中性緩沖福爾馬林液）：能完好地保存組織的形態(tài)，并使蛋白質(zhì)、核酸等大分子在細(xì)胞內(nèi)原位凝固沉

淀，防止這些物質(zhì)的崩解和彌漫流失，對(duì)大多數(shù)抗原和腫瘤基因等保存較好，是免疫組織化學(xué)和分子病理最常用的固定液，固定時(shí)

間24-36小時(shí)為宜。

4%中性緩沖甲醛固定液配方：甲醛100ml，蒸餾水900ml，磷酸二氫鈉（NaH2PO4?H2O）4g，磷酸氫二鈉（Na2HPO4）6.5g，用1N

NaOH調(diào)整pH至7.0。（由于國(guó)內(nèi)甲醛質(zhì)量不穩(wěn)定，取甲醛120ml，蒸餾水880ml，磷酸二氫鈉（NaH2PO4? H2O）4g，磷酸氫二鈉

（Na2HPO4）13g，效果更好）。

作者觀點(diǎn)：

（1）10%福爾馬林液是最常用的病理標(biāo)本固定液，由于免疫組化和分子病理的開展，我們提倡使用10%中性緩沖福爾馬林液，以便

更好地保存抗原及腫瘤基因。我們對(duì)很多組織分別使用10％中性緩沖福爾馬林液和10%福爾馬林液固定后進(jìn)行免疫組化結(jié)果對(duì)照，

雖然發(fā)現(xiàn)大多數(shù)抗原保存差異并不是很明顯，但是，對(duì)少數(shù)組織的抗原和FISH癌基因檢測(cè)（如Her-2）等影響較為明顯。因此應(yīng)該

使用10％中性緩沖福爾馬林液，如果星期六、星期日休息的單位，應(yīng)該在固定時(shí)間結(jié)束后，把組織長(zhǎng)時(shí)間停留在75%乙醇、95%酒精

中。

（2）由于HE染色核的等電點(diǎn)pH為3.3-3.6，經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林液固定后，在一定程度上改變了細(xì)胞核的pH值，影響細(xì)胞核與

蘇木精染料的結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞核容易發(fā)灰，特別是固定不充分的情況下。

（3）固定不佳的組織，由于脫水劑（乙醇）能使蛋白質(zhì)發(fā)生凝固，使脫水劑難以滲入到組織中去，造成組織脫水不佳；同時(shí)乙醇

又起到凝固性固定的作用，使交聯(lián)與凝固性固定在不同程度上混合，對(duì)抗原的保存起到了不良的影響（如AAF固定液）。因此，固

定是組織處理過程中最重要的一步：固定充分的組織，由于固定液已經(jīng)全部滲透到組織中去并與組織結(jié)合，細(xì)胞質(zhì)、組織結(jié)構(gòu)都已

經(jīng)固定，脫水劑很容易將組織中的固定液和水分置換出來，因此固定好的組織很容易脫水；同時(shí)固定不足對(duì)抗原的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了

固定過度所造成的影響。

（4）固定時(shí)間、固定液濃度與滲透速度：手術(shù)切除器官及腫瘤標(biāo)本的固定和取材后標(biāo)本的固定不盡相同，手術(shù)切除標(biāo)本，由于具

有一定的立體外形、包膜等，固定液濃度過高，往往會(huì)過引起周圍組織收縮，影響固定液浸透到組織深處，造成組織中央固定不

佳；固定液濃度過低，容易造成組織邊緣水腫而組織中央固定不佳的現(xiàn)象。當(dāng)手術(shù)標(biāo)本過大時(shí)，如脾、腎、全胃、腸等臟器，由于

滲透速度的因素：10% 福爾馬林液固定液，24小時(shí)只能穿透2-3mm的實(shí)體組織和5mm的多孔疏松組織（滲透的速度受標(biāo)本的致密度、

包膜的厚度、包膜外有無脂肪包裹、固定液的量、溫度等因素影響；而取材后的組織，上下二面組織被刀切過，固定液容易滲

透），如標(biāo)本的厚度超過5mm，經(jīng)24小時(shí)固定后，通常只有靠近邊緣1-2mm左右的組織固定好，而中央的組織固定不佳，甚至腐爛。

因此此類標(biāo)本應(yīng)該切開固定，剖開標(biāo)本厚度以3-5mm為佳，當(dāng)標(biāo)本超過厚度后，甲醛與組織的結(jié)合速度會(huì)變慢。

第二天取材后的標(biāo)本，脫水前還應(yīng)該固定6-8小時(shí)。

在一定范圍內(nèi)，固定液濃度高，所需固定時(shí)間短（但固定濃度過高，組織容易發(fā)硬，細(xì)胞收縮明顯）；而固定液濃度低，所需固定

的時(shí)間長(zhǎng)（過低的固定液濃度，會(huì)導(dǎo)致組織水腫，還容易引起組織變質(zhì)）。因此合適的固定液濃度，不僅能快速的固定組織，還能

保存其優(yōu)良的細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和抗原。

（5）固定速度與溫度的關(guān)系：固定液溫度（加溫或室溫）越高，固定速度越快，所需的時(shí)間就越短，同時(shí)細(xì)胞收縮也越明顯，

抗原丟失也越多，過高的溫度還會(huì)加速組織的腐爛（當(dāng)標(biāo)本體積大，組織中間固定液還未滲透到的部分由于溫度升高，細(xì)胞開始變

質(zhì)）；反之，溫度低，固定速度就慢，過慢的固定速度同樣也會(huì)使固定液未滲透到的組織發(fā)生變性。因此選擇合適的厚度和固定溫

度非常重要，大體標(biāo)本應(yīng)該剖開后在室溫下固定，取材后標(biāo)本可選擇室溫18℃-25℃固定。當(dāng)室溫開始下降后，應(yīng)該逐漸延長(zhǎng)固定

時(shí)間，最好能在37-45℃恒溫箱（或在全自動(dòng)恒溫密封式脫水機(jī)）內(nèi)固定。

（二）其它固定液：

（1）乙醇 CH3CH2OH：易燃、易揮發(fā)的無色透明液體，還原劑，可以被氧化成為乙醛，不能與鉻酸、重鉻酸鉀等氧化劑配成固定

液。優(yōu)點(diǎn)：①乙醇有固定，硬化和脫水的作用。②保存糖原可用100%乙醇固定。③在保存漿、膜抗原上比10%中性福馬林更好。缺

點(diǎn)：①滲透力較弱，容易造成表面發(fā)硬，固定液較難滲透到組織深部。②能沉淀核蛋白，但沉淀物溶于水，導(dǎo)致核的著色不良。③

可溶解血紅蛋白和損害多種色素。④固定速度較慢。⑤對(duì)某些抗原有損傷。⑥對(duì)核抗原保存不利。⑦能引起組織、細(xì)胞的收縮。

95%乙醇常用于細(xì)胞涂片固定，組織標(biāo)本固定一般不采用，只有在沒有福爾馬林的情況下，才能臨時(shí)使用，等送到有福爾馬林的科

室后應(yīng)立即更換。目前很多環(huán)保固定液均為醇性固定液。

圖1-12 95%乙醇固定的組織,組織表面硬化

（2）乙酸 CH3COOH ：又稱醋酸，由于該液體在氣溫16.6℃以下時(shí)，會(huì)結(jié)成冰狀固體，所以又稱冰醋酸。乙酸能沉淀核蛋白，使未

分裂細(xì)胞核的染色質(zhì)沉淀成塊狀，可以清楚地顯示細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)。乙酸滲透性強(qiáng)，固定快，可以使組織膨脹，因此最好與其它液體

配合使用。如甲醛乙酸液：10ml甲醛，5ml乙酸，85ml水，對(duì)于HE切片固定效果好，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，染色對(duì)比鮮明。但乙酸不能沉

淀白蛋白，也不能固定脂肪、糖和類脂。

（3）苦味酸（ 2,4,6-三硝基苯酚）：黃色晶體，密度1.767，凝固點(diǎn)122.5℃，爆炸點(diǎn)300℃，常制成飽和溶液貯藏。能沉淀蛋白

質(zhì)，具有軟化組織的作用，同時(shí)還具脫鈣的作用。一般與其它液體配合使用，如Bouin液：飽和苦味酸水溶液75ml，甲醛20ml，乙

酸5ml。Bouin液是骨髓、睪丸等組織固定的良好固定液，適用于結(jié)締組織染色，尤其是三色染色時(shí)更為理想。由于固定液偏酸，pH

為1.7左右，對(duì)抗原有一定的損害，不適宜于標(biāo)本的長(zhǎng)期保存，固定時(shí)間12-24小時(shí)。經(jīng)苦味酸或Bouin液固定后的組織必須流水沖

洗4小時(shí)以上。

（4）B-5固定液（乙酸鈉-升汞-甲醛固定液）：滲透力較強(qiáng)，多用于固定淋巴組織。固定液配方：無水乙酸鈉1.25g，升汞6g，甲

醛10ml（用時(shí)加入），蒸餾水90ml。如果在此配方中不加甲醛，即為B-4固定液。凡使用B-5等用具有汞成分固定的組織，在染色

前，都必須先用0.5%碘酒（70%乙醇加入碘）脫汞處理。

（5）重鉻酸鉀 K2Cr2O7 ：橙紅色板狀結(jié)晶，與可燃物接觸可能著火。比重2.676，熔點(diǎn)398℃，有毒性。常用1%-3%水溶液作固

定，穿透力極強(qiáng)，組織收縮??；可使蛋白質(zhì)變?yōu)椴蝗苄裕荒苁沟鞍踪|(zhì)沉淀（但在溶液中加入乙酸后，也能使蛋白質(zhì)沉淀）；對(duì)線

粒體、高爾基氏體的固定效果較好。重鉻酸鉀固定液的缺點(diǎn)是可使染色質(zhì)溶解。經(jīng)重鉻酸鉀固定的組織必須流水沖洗12小時(shí)以上。

（6）戊二醛 C5H8O2： 帶有刺激性氣味的無色透明油狀液體。戊二醛對(duì)糖蛋白、糖原、微管、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞基質(zhì)等都有較好的固

定作用，穿透力比四氧化鋨強(qiáng)，能保存某些酶的活力，長(zhǎng)時(shí)間的固定也不會(huì)使組織變脆。但不能保存脂肪，對(duì)細(xì)胞膜的顯示也較

差，也無電子染色作用，所以戊二醛（2.5%水溶液）只能作電鏡組織處理的前固定，固定時(shí)間需2小時(shí)以上。

（7）鋨酸OsO4 ：白色或淡黃色晶體，劇毒，強(qiáng)氧化劑，在使用時(shí)要注意對(duì)眼睛、呼吸器官、皮膚的保護(hù)。鋨酸對(duì)蛋白質(zhì)、脂肪、

脂蛋白固定良好。有較強(qiáng)的電子染色作用，組織樣本圖象反差好，所以鋨酸（1%水溶液）常作電鏡組織處理的后固定。固定時(shí)間視

環(huán)境溫度而有所不同，室溫高于18℃-20℃時(shí)1小時(shí)，低于18℃-20℃時(shí)1.5?2.0小時(shí)（屬作者個(gè)人經(jīng)驗(yàn)）。缺點(diǎn)是固定時(shí)間過長(zhǎng)容易

造成組織發(fā)脆，不容易切片。需在臨用前幾天配制以確保其充分溶解。

（8）Carnoy液：對(duì)于染色體固定較好，能很好地顯示DNA和RNA，固定速度快，一般3mm厚的組織塊固定1小時(shí)左右，較厚組織最好

也不要超過4小時(shí)。

固定液配方：乙酸10ml，氯仿30ml，無水乙醇60ml。

（9）Helly液：也稱Zenker福爾馬林液。對(duì)細(xì)胞質(zhì)的固定較好，特別是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的特殊顆粒、胰島以及心肌閏盤保存都有良好的效

果。因其含有汞成分，故在染色前，應(yīng)先用0.5%碘酒（70%乙醇加入碘）脫汞處理。

固定液配方：重鉻酸鉀2.5g，升汞5g，蒸餾水100ml，甲醛5ml。

（10）Kanovsky液：對(duì)細(xì)胞抗原、微細(xì)結(jié)構(gòu)的保存較單純使用戊二醛效果要好，常用于免疫電鏡標(biāo)本的前固定，一般采用先灌注、

再浸泡的固定方法。固定時(shí)間10-30分鐘，然后用緩沖液漂洗。最后用蔗糖液浸泡，恒溫冷凍切片。

固定液配方：25%戊二醛10ml，40%甲醛5ml，0.2mol/L二甲胂酸鈉緩沖液49ml，無水氯化鈣50mg，蒸餾水33.5ml（最后加入），

pH7.3。

（11）Rossman液：常用于糖原的固定。組織固定12-24小時(shí)后，用95%乙醇洗，無水乙醇脫水。

固定液配方：無水乙醇苦味酸飽和液90ml，甲醛10ml。

（12）Zenker液：對(duì)免疫球蛋白、病毒包涵體（如Negri小體）的固定效果較好，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)染色比較清晰，常用于三色、磷

鎢酸-蘇木精等特殊染色的固定。對(duì)于含血量較多的標(biāo)本不適合。固定時(shí)間12-36小時(shí)，加熱可加快固定作用。

固定液配方：儲(chǔ)存液由重鉻酸鉀2.5g，升汞5g，蒸餾水100ml 組成，用時(shí)再加入乙酸5ml。配法：將重鉻酸鉀和升汞加入蒸餾水，

加溫至40-50℃溶解，冷卻后過濾，保存于棕色玻璃磨砂瓶?jī)?nèi)。此液不能用金屬容器盛放，組織固定后，也不能用金屬鑷子夾取，

如果此配方中的乙酸用甲醛代替即為Helly液。

用Zenker液固定后的組織必須流水沖洗12小時(shí)去除重鉻酸鉀（也可用亞硫酸鈉溶液或1%的氨水溶液洗滌），在脫水前要先用0.5%碘

酒（70%乙醇加入碘）脫汞處理。

（13）4%多聚甲醛液：常用于免疫組織化學(xué)組織的固定。

固定液配方：4g多聚甲醛，溶于100ml蒸餾水，加溫至60℃，攪拌溶解。多聚甲醛不容易溶解，也可將液體放于密封瓶中，60℃溫

箱過夜溶解。

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